01

背景介紹

1974年nesha，Albert Claude因其在細(xì)胞結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上nesha的發(fā)現(xiàn)和研究獲得諾貝爾獎。亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)是比細(xì)胞結(jié)構(gòu)更細(xì)化的結(jié)構(gòu)，一般在電子顯微鏡下才能看見。它們的特點(diǎn)是在細(xì)胞內(nèi)，功能和空間相互隔離，又共同協(xié)調(diào)維持完整的細(xì)胞功能。在一定范圍內(nèi)，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等同于細(xì)胞器，不過像細(xì)胞膜雖然可以叫亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但不是細(xì)胞器。每種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中都存在一組特定的蛋白質(zhì)，亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)為這些蛋白質(zhì)行使功能提供nesha了相對獨(dú)立的生命活動場所。

圖1 動物細(xì)胞（左）和植物細(xì)胞（右）的亞顯微結(jié)構(gòu)模式圖（Date from ThoughtCo. alison Czin

亞細(xì)胞定位是指某種生物大分子物質(zhì)或脂類在細(xì)胞內(nèi)的具體存在部位。蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)過翻譯并合成，由蛋白質(zhì)分選信號（Sorting signals）引導(dǎo)而被轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中以參與細(xì)胞的各種生命活動，這一過程稱為蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位。蛋白質(zhì)的功能、代謝以及相互作用等都與其亞細(xì)胞定位密切相關(guān)，成熟蛋白質(zhì)必須在特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中才能發(fā)揮正確的生物學(xué)功能，如果定位發(fā)生偏差，將對細(xì)胞功能甚至生命產(chǎn)生重大影響，因此對蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的研究具有重要意義。

蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位研究的技術(shù)方法有：

Method 01

融合報告基因定位法

主要指將綠色熒光蛋白（GFP）及其衍生蛋白、β-葡萄糖苷酸酶（GUS）等報告基因，與目標(biāo)蛋白基因融合在一起，由目標(biāo)蛋白的引導(dǎo)信號進(jìn)行亞細(xì)胞定位，對報告蛋白的光信號進(jìn)行跟蹤和觀察，從而確定目標(biāo)蛋白的定位。該方法是目前使用最廣泛的蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位研究方法。

Method 02免疫熒光標(biāo)記定位法

該方法主要將免疫反應(yīng)與化學(xué)光學(xué)信號相結(jié)合，通過特異性的熒光標(biāo)記抗體與目標(biāo)蛋白（抗原）結(jié)合，通過熒光信號檢測，確定目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞位置。目前抗體標(biāo)記信號不局限于熒光素，還有同位素、酶、膠體金顆粒、納米金屬顆粒等。Method 03亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離定位法

該方法是通過超速離心等技術(shù)分離各亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，然后從分離物種進(jìn)一步提取蛋白質(zhì)，對目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析或檢測，從而獲得目標(biāo)蛋白的定位。本方法適合研究某蛋白質(zhì)組級別的細(xì)胞器定位，通常與雙向凝膠電泳分離和質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合。Method 04生物信息學(xué)預(yù)測

這是一種輔助方法，預(yù)測結(jié)果可以作為參考，但是無法作為事實(shí)判斷。隨著生物大數(shù)據(jù)的積累和機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)的發(fā)展，目前的亞細(xì)胞定位預(yù)測已經(jīng)比較準(zhǔn)確，而且存在各種物種細(xì)分，我們后面會專門用一篇文章介紹蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測。

02亞細(xì)胞定位位置及分布

圖2 植物細(xì)胞的各細(xì)胞器，來源：Sciencefacts.net

細(xì)胞中的細(xì)胞器種類細(xì)分有十幾種，如果再考慮細(xì)胞器的亞結(jié)構(gòu)，那亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)就有幾十種。以植物細(xì)胞為例，主要細(xì)胞器就有：細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體、高爾基體、液泡、核糖體、過氧物酶體，更為詳細(xì)的劃分可以參考圖2。一般，將真核細(xì)胞的亞細(xì)胞定位分為11類：細(xì)胞骨架（Cytoskeleton）、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)（Cytosol）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic）、內(nèi)體（Endosome）、細(xì)胞外間隙（Extracellular space）、高爾基體（Golgi body）、線粒體（Mitochondrion）、細(xì)胞核（Nucleus）、過氧化物酶體（Peroxisome）、細(xì)胞膜（Plasma membrane）、液泡（Vacuole）[1]。其中，細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)（Cytosol）在很多資料和報道里也被叫做細(xì)胞質(zhì)（Cytoplasm），這可能是一種習(xí)慣性叫法，但這是不太嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?。?yán)格來說，細(xì)胞器與細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、細(xì)胞骨架統(tǒng)稱為“細(xì)胞質(zhì)”。Sebastian等[2]就把Cytosol更換為Cytoplasm，并且去掉nesha了Cytoskeleton，而添加了溶酶體（Lysosome）或者植物細(xì)胞特有的質(zhì)體（Plastid）。而UniProt就沒有嚴(yán)格區(qū)分細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)，它將“Cytoplasm”定義為包含細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和細(xì)胞骨架，在分類時主要使用Cytoplasm，由此可見這兩種叫法都是可以的。03核與質(zhì)的抉擇根據(jù)Binder等[3]和Tanz等[4]的報道，可以看出無論是植物細(xì)胞還是動物細(xì)胞，定位到細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的蛋白質(zhì)都是最多的，其次是線粒體、質(zhì)體、細(xì)胞膜。表1 不同物種細(xì)胞蛋白質(zhì)定位到核或質(zhì)的比例

▲：數(shù)據(jù)來源：UniProt

那么對于一個蛋白質(zhì)，到底定位到何種細(xì)胞器呢nesha？這取決于蛋白質(zhì)上的分選信號和被定位細(xì)胞器的分選受體。比如，轉(zhuǎn)運(yùn)肽（分選信號）會被線粒體上的轉(zhuǎn)位因子（分選受體）識別、處理，完成蛋白質(zhì)定位到線粒體的活動。蛋白質(zhì)分選信號可以分為兩類：一是信號序列（Signal sequence），包括導(dǎo)肽（N端）和信號肽（可在多肽鏈的任何位置），通常是15-60個氨基酸殘基的連續(xù)短肽，且完成蛋白質(zhì)的定向轉(zhuǎn)移后可能被信號肽酶切除。二是信號斑（Signal patch），由位于多肽鏈不同部位的幾個特定氨基酸序列經(jīng)折疊后形成的斑塊區(qū)，信號斑是一種三維結(jié)構(gòu)，完成分選任務(wù)后仍然存在。

圖3 蛋白質(zhì)分選信號

1982年，R. Laskey等[5]發(fā)現(xiàn)核內(nèi)含量豐富的核質(zhì)蛋白的C端有一個信號序列，可引導(dǎo)蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，稱作核定位信號（Nuclear Localization Signal，NLS）。第一個被確定的NLS來自病毒SV40的大T抗原，它在胞質(zhì)中合成后很快積累在核中，其序列為：PKKKRKV。當(dāng)然這不是唯一序列，Dingwall等[6]分析了NLS的序列特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)一種核心二分NLS結(jié)構(gòu)，即兩個堿性氨基酸簇由約9-10個氨基酸間隔開，其基本正則表達(dá)式為RP[XXXXXXXXX]KKK，但是僅有這一核心區(qū)還不能使外源蛋白定位至細(xì)胞核，兩端的序列也是必須的。Ray等[7]比較了SV40大T抗原、NLP（AVKRPAATKKAGQAKKKKLD）、EGL-13（MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN）、c-Myc（PAAKRVKLD）和TUS蛋白（KLKIKRPVK）的核定位效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與SV40相比，c-Myc的NLS的核定位效率明顯更高。與核定位信號相對應(yīng)的是核輸出信號（Nuclear Export Signal，NES），一般是由四個疏水氨基酸殘基組成的肽段，能將蛋白從細(xì)胞核通過核孔復(fù)合體運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)。Wen等[8]報導(dǎo)了一個NES，可觸發(fā)cAPK-PKI復(fù)合物從細(xì)胞核中快速輸出到細(xì)胞質(zhì)，其信號序列為：LALKLAGLDI。NLS是判斷一個蛋白質(zhì)是否定位到細(xì)胞核的重要標(biāo)志，而含NES的蛋白可能存在核與基質(zhì)兩種定位。

圖4 5個NLS-eGFPs的核定位效率分析結(jié)果（Ray et al., 2015）

此外，蛋白質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中合成，而復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等遺傳活動又在細(xì)胞核中進(jìn)行，核與基質(zhì)之間存在大量的蛋白質(zhì)交換活動。這些蛋白質(zhì)入核又出核，并不是分選信號這么簡單。G?rlich等[9]在報道中詳細(xì)介紹了蛋白質(zhì)在核與質(zhì)之間穿梭的機(jī)理，感興趣的同學(xué)可以去仔細(xì)了解一下（這是一篇高引論文，非常值得讀一讀）。

圖5 經(jīng)典的NLS依賴輸入途徑（G?rlich et al., 1999

最后，關(guān)于蛋白質(zhì)的NLS分析，這里提供4個比較流行的預(yù)測網(wǎng)站，可以幫助大家預(yù)測和分析核定位結(jié)果：

1. NLSdb[10]：https://rostlab.org/services/nlsdb/，輸入序列后會輸出一個表格，包括不同方法預(yù)測的結(jié)果，使用起來十分簡潔，具體使用方法及結(jié)果解釋可參考其文獻(xiàn)。2. NucPred[11]：https://nucpred.bioinfo.se/cgi-bin/single.cgi，本網(wǎng)站提供預(yù)測的得分和NLS在序列上的可視化位置，得分越高可信度越高。3. INSP[12]：http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/INSP/，上海交大模式識別與生物信息學(xué)研究組開發(fā)的亞細(xì)胞預(yù)測工具集之一，使用三種不同的算法模型預(yù)測，以郵件發(fā)送預(yù)測結(jié)果。4. SeqNLS[13]：http://mleg.cse.sc.edu/seqNLS/，可以指定過濾閾值，給出閾值以上的可能序列和得分，得分越高越可靠。04多重定位的糾纏一個蛋白質(zhì)定位到2個及以上的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上，在蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位研究中非常常見，部分“活躍”的蛋白甚至可以在5-6個亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)間穿梭。其中，最為常見的就是額外定位到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)或細(xì)胞核，而且經(jīng)常發(fā)生的是預(yù)期定位到核的蛋白，還會觀察到基質(zhì)的定位，或者反之。這令研究人員十分苦惱，實(shí)驗(yàn)結(jié)果明明沒有問題，但又不好解釋，可能還會被審稿人質(zhì)疑。誠然，不同的實(shí)驗(yàn)方法對多重定位結(jié)果有一定影響，在Tanz等[4]的報道中，免疫熒光（IF）驗(yàn)證的定位中，額外定位到細(xì)胞骨架的蛋白質(zhì)的數(shù)量是熒光蛋白融合（FP）方法的2倍，而FP檢測到額外定位到胞外的情況又顯著多于IF。但有60%的蛋白存在多重定位的情況，并且這些蛋白都經(jīng)過FP和IF的雙重驗(yàn)證的，可以排除抗體交叉反應(yīng)，熒光蛋白干擾或者人工誤差的可能。蛋白質(zhì)的分選信號可能有多種定位功能，因此會出現(xiàn)多重定位的情況，尤其是含有多重跨膜區(qū)的蛋白，可以在多種細(xì)胞器膜間穿梭。我們會在后面專門寫一篇“諸膜之戰(zhàn)”的文章介紹。但是，在分選信號決定的位置之外的額外定位，原因又是多方面的，蛋白質(zhì)表達(dá)的時空變化，細(xì)胞結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，刺激誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移效應(yīng)，蛋白質(zhì)修飾及相互作用，細(xì)胞周期的依賴性等，這提醒我們，單次靜態(tài)圖像無法捕捉完整的亞細(xì)胞定位活動，可以多時段采集結(jié)果，甚至多次重復(fù)驗(yàn)證。細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)雙定位是糾紛最多的點(diǎn)，如果雙定位被質(zhì)疑或者與同類蛋白的報道不一致，怎么解決或解釋呢？1. 實(shí)驗(yàn)上，如果有條件，盡量采取2種及以上的方式去驗(yàn)證，設(shè)置平行實(shí)驗(yàn)，排除驗(yàn)證方法及人為因素的影響。2. 盡量獲得動態(tài)結(jié)果，比如分為不同時段觀察定位結(jié)果、采用不同宿主物種來重復(fù)實(shí)驗(yàn)。由于蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位的一個決定性因素是宿主細(xì)胞器的分選受體，異源表達(dá)目標(biāo)蛋白時，因此宿主分選受體的差異導(dǎo)致的定位偏差是有可能的。3. 如果實(shí)驗(yàn)確定雙定位結(jié)果無誤，可以從蛋白質(zhì)互作的角度去解釋，一般互作的蛋白應(yīng)該處于同一亞細(xì)胞位置，如果已知互作蛋白定位于核，那么目標(biāo)蛋白可能定位到核也可能是雙定位，反之亦然。Shin等[14]的報道中，有大量這樣的實(shí)例，記錄于文章補(bǔ)充材料3中，可以作為解釋證據(jù)。如果想要通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，可以敲除或干擾互作蛋白的表達(dá)，再在缺失宿主中重新亞細(xì)胞定位，還可以同時轉(zhuǎn)入互作蛋白的抑制蛋白，再進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。4. 基于生信預(yù)測，分析NLS與NES的可能性，含有弱NLS或NES信號的蛋白可能因?yàn)橹荒懿糠秩牒嘶虺龊?，出現(xiàn)雙定位是正?，F(xiàn)象。5. 基于蛋白質(zhì)序列一致性預(yù)測目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位，將目標(biāo)蛋白質(zhì)在UniProt數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast，序列一致性高（>60%）的蛋白可以作為參比蛋白，如果參比蛋白存在雙定位的情況，目標(biāo)蛋白也可能存在雙定位。

References:

[1] Lei X J, Zhao J, Fujita H, et al., Predicting essential proteins based on RNA-Seq, subcellular localization and GO annotation datasets. Knowledge-Based Systems. 2018.

[2] Sebastian B, J?rg R, and Oliver K, YLoc--an interpretable web server for predicting subcellular localization. Nucleic Acids Research. 2010, 38: W497-W502.

[3] Binder J X, Pletscher-Frankild S, Tsafou K, et al., COMPARTMENTS: unification and visualization of protein subcellular localization evidence. Database. 2014.

[4] Tanz S K, Castleden I, Small I D, et al., Fluorescent protein tagging as a tool to define the subcellular distribution of proteins in plants. Frontiers in plant science. 2013, 4: 214.

[5] Dingwall C, Sharnick S V, Laskey R A, A polypeptide domain that specifies migration of nucleoplasmin into the nucleus. Cell. 1982, 30(2): 449-458.

[6] Dingwall C, Robbins J, Dilworth S M, et al., The nucleoplasmin nuclear location sequence is larger and more complex than that of SV-40 large T antigen. J Cell Biol. 1988, 107(3): 841-849.

[7] Ray M, Tang R, Jiang Z, Rotello VM. Quantitative tracking of protein trafficking to the nucleus using cytosolic protein delivery by nanoparticle-stabilized nanocapsules. Bioconjug Chem. 2015, 26(6): 1004-7.

[8] Wen W, Meinkotht J L, Tsien R Y, et al., Identification of a signal for rapid export of proteins from the nucleus. Cell. 1995, 82(3): 463-473.

[9] G?rlich D, Kutay U. Transport between the cell nucleus and the cytoplasm. Annu Rev Cell Dev Biol. 1999, 15: 607-60.

[10] Nair R, Carter P, Rost B. NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic acids research. 2003, 31(1): 397-399.

[11] Brameier M, Krings A, MacCallum R M. NucPred-predicting nuclear localization of proteins. Bioinformatics. 2007, 23(9): 1159-1160.

[12] Guo Y, Yang Y, Huang Y, et al., Discovering nuclear targeting signal sequence through protein language learning and multivariate analysis. Analytical biochemistry. 2020, 591: 113565.

[13] Lin J, Hu J. SeqNLS: nuclear localization signal prediction based on frequent pattern mining and linear motif scoring. PloS one. 2013, 8(10): e76864.

[14] Shin C J, Wong S, Davis M J, et al., Protein-protein interaction as a predictor of subcellular location. BMC systems biology. 2009, 3(1): 1-20.